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慢病毒包装技术服务

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慢病毒( Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae),为RNA病毒,如人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于对HIV-1的研究最广泛最深入,对其生物学特性最为了解,因此HIV-1来源的慢病毒载体已成为其中的代表。


图1 HIV-1 RNA结构图
HIV-1为双链RNA病毒,共有9个基因,如图1所示。gag、pol、env3个基因编码病毒的基本结构,tat、rev为调节基因,vif、vpr、vpu、nef 4个为辅助基因。其中,gag基因编码病毒的核心蛋白,包括基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白;pol基因编码病毒复制所需的酶,如反转录酶、整合酶、蛋白酶,env基因编码病毒的包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。rev编码的蛋白调节gag、pol、env的表达水平,tat编码的蛋白参与RNA转录的控制。4个辅助基因编码的蛋白则作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染。两端为长末端重复序列(LTR),内含复制所需的顺式作用元件,如包装信号元件Ψ。
第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表,该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代,3’LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分别构建在两个质粒上,一个表达gag和pol,另一个表达env。载体质粒携带了5’端LTR,和全部5’端非翻译区域,另外还带有rev应答元件(RRE)。包膜表达质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒的env基因。
第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进,在包装质粒中删除了HIV的所有辅助基因(vif、vpr、vpu和nef基因)。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力,同时增加了载体的安全性。
第三代慢病毒载体系统由四质粒代替原有的三质粒包装系统。将rev基因单独放在一个包装质粒上。同时又增加了两个安全特性:一是构建自身失活的慢病毒载体,即删除了U3区的3′LTR,使载体失去HIV-1增强子及启动子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA;二是去除了tat基因,用异源启动子序列代替,这样原始的HIV-1基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。

慢病毒优点
1 宿主范围广  包装病毒时用VSV-G基因代替了原病毒的env基因,宿主范围更广,如神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。 
2 感染能力强  慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,能感染绝大多数细胞,对一些难于转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞有较好的感染效率。    
3 具有整合能力  慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达,因此可用于构建稳定表达目的蛋白/RNAi的细胞株,也可以用于制备转基因动物。 


整体实验流程

慢病毒包装技术路线:


包装过程:
1) 转染前一天,将细胞接种到100mm dish中,控制细胞转染时的密度为70-80%。
2) 转染前一小时取出细胞培养板,去除原有细胞培养基,加入10ml的Opti-MEM培养基,将细胞放回培养箱。
3) 制备转染试剂和质粒的复合物: 
n 将待转染的病毒载体质粒32μg(骨架质粒:穿梭质粒=1:1)溶于Opti-MEM培养基,总体积为500μl,轻轻混匀,静置5min。 
n 将Lipofectmin2000转染试剂溶于Opti-MEM培养基,总体积为500μl,轻轻混匀,静置5min。 
n 将Lipofectmin2000转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中,边加边轻轻混匀后在室温放置20min,使DNA和Lipofectmin2000转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
n 取出细胞培养板,将上面配好的DNA- Lipofectmin2000转染试剂复合体加入到细胞培养板中,做好标记,放回培养箱。
n 6h后吸去培养基,PBS洗一次,加入10ml新鲜完全培养基培养。

收毒:
1) 转染48h后,第一次收毒,收集培养基至50ml离心管中,做上标记,并给细胞更换新鲜的完全培养基。
2) 转染72h后,第二次收毒,收集培养基至50ml离心管中,做上标记,丢弃细胞。
注:废弃的含病毒的培养基加入84消毒液(1:20左右),浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头,离心管,培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理,也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌(121℃,30min)处理。

3. 慢病毒纯化:
1) 普通离心机:3500rpm,10min,RT离心后,上清马上倒入新的50ml离心管,0.45μm,过滤上清到超速离心管中。上清分装到12支超速离心管,两两对应配平衡,不够的体积可用不含血清的培养基配平。
2) 超速离心机:HITACHI,30,000rpm,2h,4℃,离心后,可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀,做上记号。在安全柜中,打开离心管,小心地弃上清,离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上,弃未去除干净的上清。每管根据沉淀量添加DPBS,80μl-120μl/管,用封口膜封住管口,4℃溶解沉淀过夜。
3) 将同一种病毒,逐管收集法收集病毒到最后一管,再用100μl DPBS收集2次,全部收到1.5ml 离心管中,按要求分装病毒,标记(病毒名称,年-月-日)-80℃冰箱保存。

4. 慢病毒滴度检测(Real time 定量PCR 法测定滴度):
1) 样品制备:
a) 消化293T细胞,按1×105细胞每孔接种24孔板。
b) 细胞贴壁后(铺板后4~6h)加入病毒。
c) 12~20h后换液,去掉含病毒的培养基。
d) 感染后72h拍照记录荧光,收集细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。
2) Real-time PCR 检测:
Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 来自TAKARA。
a) 下列比例配置反应体系:


b) 设定程序为两步法Real-Time 定量。预变性95℃,15s,之后每一步变性95℃,5s,退火延伸60℃,34s,共进行40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
Cycle 2: (40X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
Step 2: 60.0 ℃ for 00:34.
Data collection and real-time analysis enabled.
c) 制作熔解曲线。PCR 结束后, 在95℃变性1min。然后冷却至55℃,使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持30s, 同时读取吸光值。
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃

服务流程:

客户提供 签订合同支付预付款→ 上海觅拓生物 交付结果交付尾款→ 客户得到
目的基因序列信息
腺病毒载体构建
与合同对应的病毒量以及对照病毒
病毒载体要求
病毒包装纯化
详细的实验报告
其它要求
滴度测定等


上海觅拓生物提供的慢病毒

我们采用第三代4质粒慢病毒包装系统,生物安全性更高; 

采用VSV-G包膜,宿主范围更广; 
产生的慢病毒滴度高,可达108~1010TU/mL; 
各种慢病毒穿梭载体可供选择:过表达、ShRNA、miRNA、Tet诱导表达载体等; 
可带有荧光报告基因(GFP、RFP、mCherry、Luciferase等)和药筛标记基因(Puromycin、Neomycin、Hygromycin等),有多种启动子(CMV、PGK、CAG、Ubc等)可供选择; 
3~4周内即可完成病毒包装服务。

运输和储存 
对于长距离运输,应先将慢病毒载体保存在-80℃,再采用全程干冰运输,以防滴度下降。 
慢病毒载体在-80℃保存6个月,滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品,进行实验前,重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融(小于3次)。 
使用前从-80℃取出病毒,立即放在37℃水浴锅中,轻轻晃动,使其尽快溶解,操作过程应置于冰盒上进行。用不完的毒可以暂时放在4℃冰箱中,但最好尽快用完。


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