慢病毒( Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae)，为RNA病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于对HIV-1的研究最广泛最深入，对其生物学特性最为了解，因此HIV-1来源的慢病毒载体已成为其中的代表。

整体实验流程

慢病毒包装技术路线：

包装过程：
1) 转染前一天，将细胞接种到100mm dish中，控制细胞转染时的密度为70-80%。
2) 转染前一小时取出细胞培养板，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱。
3) 制备转染试剂和质粒的复合物： 
n 将待转染的病毒载体质粒32μg（骨架质粒：穿梭质粒=1:1）溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。 
n 将Lipofectmin2000转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。 
n 将Lipofectmin2000转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和Lipofectmin2000转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
n 取出细胞培养板，将上面配好的DNA- Lipofectmin2000转染试剂复合体加入到细胞培养板中，做好标记，放回培养箱。
n 6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。

收毒：
1) 转染48h后，第一次收毒，收集培养基至50ml离心管中，做上标记，并给细胞更换新鲜的完全培养基。
2) 转染72h后，第二次收毒，收集培养基至50ml离心管中，做上标记，丢弃细胞。
注：废弃的含病毒的培养基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（121℃，30min）处理。

3. 慢病毒纯化：
1) 普通离心机：3500rpm，10min，RT离心后，上清马上倒入新的50ml离心管，0.45μm，过滤上清到超速离心管中。上清分装到12支超速离心管，两两对应配平衡，不够的体积可用不含血清的培养基配平。
2) 超速离心机：HITACHI，30,000rpm，2h，4℃，离心后，可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀，做上记号。在安全柜中，打开离心管，小心地弃上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，弃未去除干净的上清。每管根据沉淀量添加DPBS，80μl-120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀过夜。
3) 将同一种病毒，逐管收集法收集病毒到最后一管，再用100μl DPBS收集2次，全部收到1.5ml 离心管中，按要求分装病毒，标记（病毒名称，年-月-日）-80℃冰箱保存。

4. 慢病毒滴度检测（Real time 定量PCR 法测定滴度）：
1) 样品制备：
a) 消化293T细胞，按1×105细胞每孔接种24孔板。
b) 细胞贴壁后（铺板后4~6h）加入病毒。
c) 12~20h后换液，去掉含病毒的培养基。
d) 感染后72h拍照记录荧光，收集细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。
2) Real-time PCR 检测：
Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 来自TAKARA。
a) 下列比例配置反应体系：

b) 设定程序为两步法Real-Time 定量。预变性95℃，15s，之后每一步变性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共进行40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
Cycle 2: (40X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
Step 2: 60.0 ℃ for 00:34.
Data collection and real-time analysis enabled.
c) 制作熔解曲线。PCR 结束后， 在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s， 同时读取吸光值。
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃

服务流程：

上海觅拓生物提供的慢病毒：

我们采用第三代4质粒慢病毒包装系统，生物安全性更高； 

采用VSV-G包膜，宿主范围更广； 
产生的慢病毒滴度高，可达108~1010TU/mL； 
各种慢病毒穿梭载体可供选择：过表达、ShRNA、miRNA、Tet诱导表达载体等； 
可带有荧光报告基因（GFP、RFP、mCherry、Luciferase等）和药筛标记基因（Puromycin、Neomycin、Hygromycin等），有多种启动子（CMV、PGK、CAG、Ubc等）可供选择； 
3~4周内即可完成病毒包装服务。

运输和储存 
对于长距离运输，应先将慢病毒载体保存在-80℃，再采用全程干冰运输，以防滴度下降。 
慢病毒载体在-80℃保存6个月，滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融（小于3次）。 
使用前从-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其尽快溶解，操作过程应置于冰盒上进行。用不完的毒可以暂时放在4℃冰箱中，但最好尽快用完。