腺相关病毒属微小病毒( parvovirus)家族的成员，为无包膜的单链线状DNA病毒。AAV的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

腺相关病毒具有安全性高、免疫原性低、能介导基因在动物体内长期稳定表达，因而被认为是最有潜力成为基因治疗工具的载体而在国内外研究中广泛应用。

厦门安提海拉生物在包装腺相关病毒时有9种不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见下表。腺相关病毒可用于基因的过表达（3kb以下）、shRNA（单条或者多条串联）、miRNA（pre-miRNA或者pri-miRNA）、可诱导表达。

10种不同血清型对各组织器官细胞的亲和性
血清型	组织亲和性
AAV1	肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织
AAV2	中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼
AAV3	肌肉，肝脏，肺，眼
AAV4	中枢神经，肌肉，眼，脑
AAV5	肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺
AAV6	肺，心脏
AAV7	肌肉，肝脏
AAV8	肝脏，眼，中枢神经，肌肉
AAV9	心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经
DJ	视网膜，肝脏，肺，肾脏

1.宿主范围广：随时可转染的 AAV 可高效感染分裂和非分裂细胞； 
2.多种血清型 ：AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和 AAV9 等；
3.安全性高：ITR 序列和 rep/cap 基因分别由独立的质粒表达；未发现 AAV 对人体致 病，rAAV 去除了 wtAAV 基因组的 96%，进一步保证了安全性；
4.免疫原性低：AAV2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操 作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小； 
5.  表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；
6.  物理性质稳定：在 60℃不能被灭活，能抗氯仿

技术路线：

2.病毒包装：
（1)复苏AAV-293细胞到15cm 培养皿中。24-72h后，当细胞达到70%汇合度的时候，1:3分盘。48h后，1:10分盘。48h后可以进行质粒转染。
（2)使用obio病毒包装转染试剂，按照使用说明，三种质粒（pHelper：pAAV-RC2：pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen=1：1：1）共转染AAV-293细胞。
（3)转染60h后，使用细胞刮将细胞刮下，并收集到离心管。
（4)1500g 4℃离心5min。将细胞沉淀重悬在7ml 的 10mM Tris-HCl 缓冲液中。
（5)细胞可-80℃保存直到进行纯化。
3.病毒纯化：
（1)取细胞裂解液在干冰/乙醇浴-37℃水浴中反复冻融8次。
（2)使用10mM Tris-HCl¬将裂解液定容到21ml。
（3)使用Misonic Sonicator超声仪超声7min（输出2）。
（4)加入2ml DNase I（3mg/ml）37℃孵育30min。
（5)再次超声7min。
（6)加入2.5ml 10% 脱氧胆酸钠，2.1ml 0.25%胰酶-EDTA，混合均匀后37℃孵育30min，冰上放置20min。
（7)加入16.9g CsCl。混合均匀后，37℃孵育20min。中间摇动，直到CsCl完全溶解。
（8)4℃3000g离心30min，小心地将细胞裂解液转移到超速离心管（约5ml/tube）。
（9)4℃53,000rpm (266,400g)离心30h。
（10)使用自制的针头收集病毒层。
（11)4℃透析，12-16h换透析液，每次使用4L缓冲液。
4.滴度检测：
（1)取2μl 纯化后的病毒液加入50μl PCR 碱性裂解液中，100℃，加热10min。放置冰上10min，加入50μl中和缓冲液。（同时准备质粒对照模板：106-1011拷贝/μl）。
（2) 按照以下体系准备qPCR样品（20μl体系）：10μl SYBR green master mix， 0.3μl 正向引物，0.3μl 反向引物，1μl模板，8.4μl 水（RSV promoter：正向: GGTTGTACGCGGTTAGGAGT；反向：GGCATGTTGCTAACTCATCG）。
（3)分析滴度。

服务流程：

客户提供	签订合同支付预付款→	生物服务	交付结果交付尾款→	客户得到
目的基因序列信息		腺病毒载体构建		与合同对应的病毒量以及对照病毒
病毒载体要求		病毒包装纯化		详细的实验报告
其它要求		滴度测定等

提供的腺病毒：
1）载体全：不同的启动子（神经特异性启动子 Human Synapsin、CamkIIα、GFAP 等）和 多种报告基因（EGFP、mCherry、RFP 和 luciferase 等）可供客户选择；
 2) 货期短：AAV 克隆载体均与我们 18,000 个预制人类全长 cDNA ORF 克隆载体 MCS 区 通用，行业中最短的生产周期； 
3）滴度高：可提供 1012V.G/ml 及以上滴度的病毒.，最高可达 1014V.G/ml；
4）服务优：可根据客户的具体需求提供特殊定制服务。

产品运输储存
对于长距离运输，应先将腺相关病毒载体保存在-80℃，再采用全程干冰运输，以防滴度下降。收到产品后，请第一时间在 BL2 生物安全柜中根据实验所需量将病毒进行分装。分装病毒 时请将病毒始终放置在冰上。分装的病毒可在 4 ℃保存 3 天，其余病毒请于-80 ℃冰箱 冻存。请避免反复冻融，否则会降低病毒滴度！