支原体检测 
  支原体清除
支原体污染是基础研究和工业生产中一个很常见的问题，可能有高达87%的细胞系发生过支原体污染。支原体是一种直径约为0.2-0.3 μm，无细胞壁的原核生物，具有变形能力，可透过常见过滤膜（孔径0.22-0.45 μm），常规的无菌过滤方法不能将其去除，细胞培养常用的青霉素和链霉素也不能清除培养物中的支原体。支原体细胞体积小，种类繁多，培养物的混浊度低，对加富培养基的需求有限，此外某些种类或菌株可能是细胞侵入性的，因此细胞被支原体污染一般难以察觉。支原体污染能耗尽营养物，促进代谢积累，导致pH改变，诱导或抑制细胞因子表达，并改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态。由于支原体污染能影响几乎每一个细胞参数，所以很多研究都强调常规筛选研究细胞系的需要，以确保观察到的结果不被污染所损害。

常见的支原体污染来源有：

1.液氮

液氮也可以成为传播支原体的媒介。支原体具有顽强的生命力，即使没有经过低温冷藏过程，支原体也可以在液氮里存活。在液氮中，支原体虽然不会增殖，但是仍可以污染保存在其中的细胞，因此建议将冻存管保存在液氮罐的气相层中。

2.忽视不了的空气悬浮物，加上不彻底的灭菌

在培养过程中产生的悬浮颗粒是微生物污染的最主要来源，一些常见的仪器或普通的实验操作都会产生这些颗粒，例如移液器、真空泵、离心机、冰箱等。培养箱都带有通气扇和CO2瓶，在开、关内门的过程中，被支原体污染的颗粒会被扰动，可能造成细胞污染。携带微生物的颗粒直径多在4-28μm之间，在静止空气中，它们以30cm/min的速率移动，因此在密闭、不通风的房间或实验室内，基本不会造成生物污染。但是，当实验者进入房间时，沉积的颗粒会被扰动，悬浮起来的颗粒则有可能污染细胞。因此严格的无菌操作意识很重要。此外，实验动物也会带来一些被污染的悬浮颗粒。

3.受污染的培养基、血清、试剂，细胞。

除上述的情况外，滥用抗生素、密封不严、也都可能是支原体污染的来源。

防止污染的方法

1.改进无菌技术、严格无菌操作

对新进实验室的人员，要由有经验的人员帮带，严格监督其实验操作；此外建议记录每一次的污染事件，以便分析解决污染问题。

2.检测外来细胞，检测疑似污染细胞，定期检测实验室细胞

因为外来的细胞携带污染很常见，因此，选择可靠的细胞来源非常重要，在没有独立细胞培养箱的情况下，可疑的细胞培养物应培养在带盖的培养瓶中，不要使用培养板或没有密封的培养皿。此外，处理这类细胞应在一天工作都结束后进行，并且使用独立的培养基和试剂，最后还要对超净工作台进行彻底除菌。由于支原体污染比较隐蔽，所以建议给细胞定期做支原体检测，以免在未察觉的情况下给您的实验造成影响。可供参考的做法是：在新细胞进入实验室时，以及细胞冻存入库前，都应该做一下支原体检测，平时每三个月常规检测一次。

3.发现污染，及时清除

大环内酯能结合细菌50S核糖体亚基，从而抑制蛋白质合成，喹诺酮则抑制细菌DNA消旋酶的活性。因此可以在细菌DNA复制及蛋白质合成两个层面上抑制细菌生长，明显增强除菌效果。这两个靶点在真核细胞内都不存在，对真核细胞无毒。 喹诺酮可以自由的穿透哺乳动物细胞，可以同时除去游离形式的及真核细胞内部的支原体，这个特点保证了经过处理的细胞不会被细胞中释放出的支原体反复感染。因此可以避免除菌后细胞内支原体的反复感染。两者适当比例，可用于细胞培养中支原体污染的清除。同时能以较低的浓度发挥广谱的抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的作用，譬如能作用于耐青霉素与链霉素的细菌，已证实其对真核细胞无毒性。由于优越的双重除菌机制，可避免抗性支原体的产生。

对于支原体污染，及时发现污染是前提，使用快速可靠的检测方法颇具必要性。支原体PCR检测可以承担这个大任。支原体PCR检测特点：①特异性引物是针对高度保守的支原体16SrRNA序列设计的，可以用于检测非常广泛的支原体种类，不会受真核细胞或细菌DNA干扰。经本试剂盒测试的支原体菌株包括：猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（M. orale）、肺炎支原体（M. pnemoniae）、精氨酸支原体（M.arginini）、发酵支原体（M. fermentans）、唾液支原体（M. salivarium）、无胆甾支原体（A.laidlawii），涵盖了所有常见的支原体污染种类；②采用降落PCR（Touchdown PCR）法扩增DNA片段，只需进行一次PCR反应，同时又比普通PCR灵敏度更高；③采用的阳性对照样品可扩增产生大小为643bp的DNA片段，使用的引物与支原体检测相同，用于判断PCR反应条件是否适合，从而鉴别假阴性结果；④本试剂盒包括了除模板外PCR反应所需的所有成分：DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液，引物和阳性对照样品，您只需要添加模板和水就可以进行PCR反应，能在2-3小时内获得可靠的结果。

对于心爱的细胞污染了支原体，再也不用狠心扔掉了所有细胞了！
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