自噬检测试剂盒
自噬检测试剂盒
Autophagy Detection Kit
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货号
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规格
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价格
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Aup-bgf-1
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1 ml
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980元
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背景知识：
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。LC3是目前公认的自噬标记物。在自噬体形成过程中，LC3 会聚集在自噬体的膜表面。哺乳动物中的LC3可分为三种： LC3a、LC3b和LC3c。 其中，LC3b作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志。
利用LC3蛋白在自噬过程中发生聚集的这一现象，将LC3b和EGFP融合在一起，使用baculovirus病毒作为运载工具，可实时展现LC3b在细胞内的位置，据此观察细胞内的自噬过程。经改造过的baculovirus病毒载体能够广泛的感染传代细胞和原代细胞，实现简化操作，同时提高转染效率。当病毒载体感染细胞后，LC3b-EGFP基因在细胞内表达，蛋白弥散的分布在细胞内；细胞发生自噬时，LC3b-EGFP蛋白聚集形成绿色的荧光点。
试剂盒组分：
LC3b-EGFP baculovirus：1ml， 滴度: 108/ml （1e8/ml）；
氯喹：100ul（1000X）， 浓度：30mM。
保存条件：
Baculovirus： -80度保存；
氯喹：-20度保存。
实验过程：
1. 根据实验的需要，接种细胞到细胞培养皿或细胞板中。由于需要高清晰的活细胞成像，推荐用玻璃底的培养皿。
2. 第二天当细胞长到50-70%的融合度，根据细胞的数目加入LC3b-EGFP AAV。一般细胞，我们推荐加入MOI=30的病毒量。可以根据细胞情况，提高或降低病毒感染的MOI以获得更好的实验结果。直接将病毒液加到细胞培养基中，过夜培养让LC3b-EGFP蛋白表达。
3. 第三天更换新鲜培养基，并加入氯喹和需要试验的药物或siRNA。将1000X的氯喹加到细胞培养基中，终浓度为30uM。加入需要试验的药物后，可以开始活细胞成像观察自噬。自噬的发生时间根据不同的药物有所不一样，阳性药在6个小时后可以观察到绿色荧光点增多，12小时后能观察到大量的荧光点聚集到细胞核周围。
4. 设置荧光显微镜，选取GFP通道（488/513）观察自噬的发生过程。
如需要固定细胞：加入新鲜的4%Paraformaldehyde，室温避光固定30min。去掉Paraformaldehyde，用PBS洗两次，加1ug/ml DAPI，室温避光30分钟染核，然后去掉DAPI，PBS洗三次后观察。
注意事项：
1. 病毒避免反复冻融，病毒一次不能使用完可以分装保存；
2. 对不同的细胞，需要优化病毒感染滴度；
3. 对于低感染效率的细胞，可以同时使用本公司的病毒增强剂VirusBoost。
