探针法支原体污染实时定量PCR试剂盒

Probe-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma Contamination

储存：-20度，避光保存，有效期一年。避免反复冻融。

支原体（Mycoplasma）是一种直径约为0.1-0.3 μm、无细胞壁的原核生物，属于柔膜菌纲(Mollicutes)，常被用作柔膜菌纲的统称。支原体具有变形能力，可透过常见过滤膜（0.22-0.45 μm），因此常规的无菌过滤方法不能将其去除，靶向细胞壁的抗生素也对其无效。由于在光学显微镜下无法判断，细胞培养中的支原体污染是一个令人烦恼的问题。支原体种类繁多，目前已知的污染细胞的支原体有20多种，一般是由试剂和人工操作带入，95%的污染事件是由常见的五种支原体引起；由原代细胞的原始组织带入而形成的污染也有发生，污染的支原体种类分布较为广泛。根据细胞类型、来源和培养方法的不同，文献报道的细胞污染率在15-80%之间，极大影响了下游实验的进行，因此必须使用专门的方法检测这些污染。

传统的培养法操作比较繁琐，需要很长时间（最长需要28天），受操作人员的实验技能影响比较大，并且有些支原体种类不能体外培养。而PCR法可有效克服上述缺点。本试剂盒采用探针法对细胞污染进行PCR检测，使用通用性探针和引物，可识别超过150种支原体。常见的污染类型，如:猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）、唾液支原体（Mycoplasma salivarium）、口腔支原体（Mycoplasma orale）、精氨酸支原体（Mycoplasma arginini）、莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii）、发酵支原体（Mycoplasma fermentans）和肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae），均可以检出。根据易感程度和与人类的密切程度，选取12种支原体进行验证，灵敏度最高可达到每反应2个基因组，大部分种类灵敏度分布在每反应2-12个基因组，最低的是解脲脲原体，灵敏度为每反应86个基因组。本试剂盒适用于检测欧洲药典要求的所有支原体种类，大部分种类可以达到欧洲药典要求的10 CFU/ml的灵敏度，考虑到支原体培养条件和菌株活性的差异，少数种类的支原体难以判断是否符合这个要求。

试剂盒包含热启动DNA聚合酶、dNTP（以dUTP代替dTTP）、引物、探针、阳性对照品。探针在5`-端以FAM修饰，3`-端以MGB修饰。引物具有柔膜菌/支原体特异性，与真核生物无交叉反应，即使与亲缘关系较近的革兰氏阳性菌，如：嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae），也无交叉反应。DNA聚合酶源自极端嗜热菌（Thermus thermophilus），经改造后较普通的Taq酶具有更强的抗抑制能力和热稳定性。通过结合特异性单克隆抗体，在室温下DNA聚合酶活性被抑制。在PCR循环的热变性阶段，抗体受热被去除，此时DNA聚合酶活性恢复，因此获得“热启动”功能。热启动可减少残余DNA的污染，提高PCR扩增效率、灵敏度和目的片段产量。