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生化试剂

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit,用于吞噬细胞标记

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产品信息

产品名称 产品编号 规格              价格(元)    
PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling       
PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)
MX4021-100UL      100μl 996
MX4021-200UL 200μl 1946
MX4021-500UL 500μl 3886
【好消息】:应客户的要求,我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应,产品信息如下:
产品名称 产品编号 规格              价格(元)    
Diluent C for General Membrane Labeling                                
稀释液C(用于常规细胞膜标记)
MX4022-10ML        10ml 296
MX4022-30ML 30ml 586
产品描述
PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH26,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。
PKH26是一种专利的膜标记探针,结构上带有一长脂肪族尾巴,能稳定插入细胞膜脂质区域。PKH26荧光处于黄-橙色光谱区间(见图1),最大激发波长为551nm,最大发射波长是567nm,与罗丹明或PE检测系统兼容。也可能用标准荧光素(Fluorescein)激发滤片,但荧光强度可能会有些降低。PKH26具最长的体内半衰期,超过100天,非常适用于体内细胞示踪、细胞增殖研究和其他长期实验。
稀释液CDiluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH26荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

1. PKH26的激发和发射光谱图
我司提供三种规格的PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记),其中:
Mini KitCAT#MX4021-100UL)建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。
Midi KitCAT#MX4021-200UL)适用于中量研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。
Maxi KitCAT#MX4021-500UL)适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定佳的染料浓度
产品包装
组分             名称 货号(规格)
MX4021-100UL     MX4021-200UL   MX4021-500UL  
MX4021-A PKH26 Dye (1×10-3M in EtOH)      1×100μl 2×100μl 5×100μl
MX4021-B Diluent C 1×10ml 2×30ml 2×30ml


保存与运输方法

保存:2-8ºC避光保存,1年有效。其中组分APKH26 Dye)需严格避光,盖子保持拧紧。
运输:冰袋运输。
注意事项
1   PKH26是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。
2   Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。
3   PKH26不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。
4   荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。
5   为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
操作步骤
一、 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)
﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)
﹒含血清的组织培养基(完全培养基)
﹒不含Ca2+Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBSHBSS
﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白
﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml
﹒能控温的离心机(高达1000×g
﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)
﹒无菌层流净化罩
﹒血球计数板或自动细胞计数装置
﹒载玻片和盖玻片
二、 常规细胞膜标记
【注意事项】:
1   通过分配脂质染料进入细胞膜来进行标记。标记强度是染料浓度和细胞浓度共同作用的一种功能,且不会饱和。因此,用来标记的染料浓度需要有限,过度标记细胞会引起细胞膜完整性丧失和降低的细胞复原能力。
2   以下步骤适用于体外或离体标记干细胞、淋巴细胞、单个核细胞、内皮细胞、神经元或任何需要将染料插入细胞膜脂质区的其他细胞类型。而体内标记、血小板标记,或在含非吞噬细胞的群体内选择性标记吞噬细胞,需对步骤做适当修改。
3   需在单克隆抗体染色前进行常规细胞膜染色。4℃单克隆抗体染色过程中膜染料仍能维持稳定。然而,如果单抗标记后再室温下进行常规细胞膜染色,极有可能引起单抗的盖帽发生。
4   以下步骤中用到的细胞和染料浓度是推荐用的起始浓度,广谱适用于各种细胞类型。用户需根据自身细胞类型和实验目的确定佳的染料和细胞浓度,通过对染色后细胞活力(比如碘化丙啶排斥),荧光强度,染色均匀性和对待研究细胞功能无影响等方面来综合评估。
5   PKH26染色过程中需避免叠氮化物或代谢毒物的存在。
6   虽然粘附在固相基质上的贴壁细胞可能被标记,使用单细胞悬浮液能得到更匀质的染色结果。染色前使用蛋白消化酶比如胰酶/EDTA处理贴壁或结合细胞制备成分散的单细胞悬液能得到好的染色结果。
【染色流程】:
以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH26,以及1×107个细胞/ml
以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。
1.1    取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。
【注意】:血清蛋白和脂质也会结合染料,降低用于膜标记的有效染料浓度。用无血清培养基或缓冲液(Step 1.1)清洗细胞一次,然后再用Diluent C重悬细胞用于标记能得到佳结果。
1.2    400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。【注意】:PKH26乙醇储存液不能直接加入细胞沉淀上,否则会引起异质染色和降低的细胞活力。
1.3    细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。
【注意】:为了得到重复性结果,最小化残留培养基或缓冲液很重要,然后再将细胞重悬在Diluent C中。
1.4    1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。
【注意】:生理盐离子的存在导致染料形成胶团,实质上降低染色效率。因此,染料添加的时候细胞悬浮在Diluent C中很重要,而不是在培养基或缓冲盐溶液中。
1.5   染色前立即制备染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH26乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。
【注意】:
a)为了最小化乙醇对细胞活力影响,Step 1.5中加入的染料体积产生占Step 1.6中不超过1-2%的乙醇量;b)若想得到<2μM的最终染料浓度,用未变性的100%无水乙醇稀释试剂盒提供的PKH26乙醇储存液到一中间染料浓度,能得到好的重复染色结果。
1.6   快速加1ml 2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml 2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml 2μM PKH26
【注意】:由于染色几乎是一瞬间发生,在染色工作液中快速且均匀分散细胞对得到明亮、一致和重复的标记结果至关重要。以下措施都有利于得到优化结果:
a.       不要将PKH26乙醇储存液直接加到染色液(4μM in Diluent C)中。
b.       混匀等体积的细胞悬液(Step 1.4)和染色液(Step 1.5)。
c.       调整细胞悬液和染色液体积,避免在很小(<100μl)或很大(>5ml)体积。
d.       使用自动移液器或相同产品用于快速添加细胞和与染料混匀。血清学移液管很慢,得到相对更不一致的染色。推压或涡旋也很慢,得到相对更不一致染色。
e.       尽可能精确加量体积,为了精确重复每个样品间和每个研究间用到的细胞和染料浓度。
1.7    Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。
【注意】:以获得理想染色结果的最短时间进行细胞孵育。由于Diluent C不含生理盐,更长的细胞孵育可能引起某些细胞类型活力降低。如果猜测可能有此效应产生,那么同时设置一个仅含Diluent的对照和一个使用乙醇染色而不是染料染色的阴性对照(mock-stained control)。
1.8    加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA),孵育1min允许结合多余的探针。
【注意】:
a.血清(或等蛋白浓度溶液)更适合用作终止液。如果用完全培养基直接替代血清提高加入体积到10ml
b. 在终止染色反应前不要通过加入Diluent C或离心细胞到Diluent C来终止。
c.不要使用无血清培养基或生理盐溶液,会引起细胞相关染料聚合物产生。染料聚合物好比未结合染料的缓释水池,通过清洗不能有效去除,且会转移到实验体系中的未标记细胞上。
1.9    20-25℃400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。
【注意】:转移到一干净离心管内能增加清洗效率,通过最小化结合到管壁上的残留染料的交叉污染;不要使用Diluent C用于清洗。
1.10  最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。
【注意】:
a.       染色细胞可能用1-2%中性缓冲甲醛固定,若样本避光保存荧光强度可稳定保存至少3周。
b.       染色通常比背景自荧光至少强100-1000倍。荧光分布必须匀称,且尽量均质,虽然染色CV取决于染色细胞类型。

PKH26客户使用案例(逐步增加中。。。。。。)

 图片描述:巨噬细胞(106个/mL)经PKH26(MKBio, 货号:MX4021-100UL,使用浓度:4uL/mL,5min)标记,荧光显微镜(Ex/Em=551nm/567nm)检测。【数据来源:华东理工大学药学院 李老师】

图片描述:斑马鱼体内给PKH26(MKBio,货号:MX4021-100UL)标记以及荧光成像。【数据来源:兰州大学医学院 潘老师 


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