| 浓度 | 1mg/mL |
| 规格 | 1mL |
| 保存条件 | 4℃ |
【使用方法】
RNAi 或 siRNA 转染
本说明书适用于 24 孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
1. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（无抗生素），接种细胞密度在 30-50%。
2. RNAi（siRNA）-NP80 混合物准备：
a) 20 pmol siRNA 用 50μl 无血清培养基稀释。
b) 2μl NP80 用 50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育 5min。（注意：确保在 25min 内执行第三步操作，不要过于延迟）
c) 孵育 5min 后，将 siRNA 稀释液与NP80 稀释液混合（总体积 100μl）。轻轻混匀，室温孵育 20 min。
3. 将 RNAi 混合物加到培养的细胞内。
a) 将 100μl 混合物加入培养孔内，培养孔内含有 0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
b) 37°C 培养 18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养 4-6h 时可以更换培养基。孵育时间的长短，取决于细胞类型、所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间
转染实验要点：
Ø 转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡；
Ø 首次实验 RNAi 或 siRNA 的用量可稍大，后续实验根据实验结果修改。
为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。例如：24 孔培养板，调整 RNAi 或 siRNA 与 NP80 试剂的用量。siRNA 用量在 10-50 pmol 之间调整，NP80 试剂用量在 0.5-1.5μl 之间调整。客户可按照、 用量进行预实验，适当调整转染试剂用量。
使用以下步骤将 DNA 在 24 孔板内转染到哺乳动物细胞中。所有的数量和体积是基于一个孔给出的。对于大多数细胞系使用 1:2 到 1:3 比例的 DNA (μg)和 NP80(μl)制备复合物。
1. 贴壁细胞:转染前 1 天，将 0.5-2×105 个细胞置于 500μL 不含抗生素的生长培养基中，使细胞在转染时融合率达到 70-90%。悬浮液细胞:在制备混合物之前，将 4- 8x105 个细胞置于不含抗生素的 500 μl 生长培养基中。
2. 对于每个转染样品，准备混合物如下:
a) 在不含血清的 Opti-MEM I Reduced Serum Medium(或其他不含血清的培养基)。
b) 使用前将NP80 在 50 μl Opti-MEM I 培养基中稀释，室温孵育 5 分钟。
c) 孵育 5 分钟后，将稀释后的DNA 与稀释后的 NP80(总体积 100 μl)结合。轻轻混合，在室温下孵育 20 分钟
(溶液可能看起来混浊)。
3. 在含细胞和培养基的每个孔中加入 100 μl 的混合物，摇匀。
4. 将细胞置于 37℃的 CO2 培养箱中培养 18-48 小时，检测转基因表达情况。培养基可在 4-6 小时后更换。
为了获得最高的转染效率和较低的细胞毒性，可以通过改变细胞密度以及优化 DNA 和 NP80 浓度转染条件。确保细胞融合度大于 90%，将DNA (μg): NP80 (μl)的比例从 1:0.5 到 1:5 进行调整。
|
NP80 Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels |
|||||||
|
Culture vessel |
Surface area/well (cm2) |
Vol. of growth medium (µl) |
Vol. of dilution medium (µl) |
RNAi 或 siRNA (pmol) |
NP80 (µl) |
DNA (µg) |
NP80 (µl) |
|
96-well |
0.3 |
100 |
2 x 10 |
5 |
0.5 |
0.2 |
0.5 |
|
48-well |
0.8 |
250 |
2 x 25 |
10 |
1 |
0.4 |
1 |
|
24-well |
2 |
500 |
2 x 50 |
20 |
2 |
0.8 |
2 |
|
12-well |
4 |
1000 |
2 x 100 |
40 |
4 |
1.6 |
4 |
|
6-well |
10 |
2000 |
2 x 250 |
100 |
10 |
4 |
10 |
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